1945年8月10日，深夜，美国国务院---陆军部---海军部协调委员会在五角大楼召开紧急会议，主要议题是在朝鲜的受降问题。助理国务卿邓恩提出美国军队接受日本投降的区域应尽可能向北推移，但国防部长马歇尔的参谋人员迪安·腊斯克上校指出，军方缺乏可供立即投入使用的兵力，加上时间和空间等因素，抢在苏军进入朝鲜南部地区之前向北部更远地区推进会有困难。于是，陆军助理部长麦克洛伊请腊斯克和另一位上校查尔斯·博尼斯蒂尔搞出"一条尽可能向北推进"，但又不致"被苏联拒绝"的分界线。
腊斯克和查尔斯曾设想按朝鲜的行政区域来划分受降界线，但身边一时没有资料。匆忙中，他注意到在地图上北纬三十八度线差不多从朝鲜中部穿过，而且汉城及其附近的集中营都在"三八线"以南，于是决定用"三八线"作为受降区域的分界线。
这个建议迅速得到美国军方和国务院的同意，并于14日被总统杜鲁门批准。15日，杜鲁门给斯大林发出密电，通报了给盟军最高司令官道格拉斯·麦克阿瑟的有关日本武装部队投降细节的"总命令第一号"，该命令的内容之一就是以"三八线"作为美苏双方在朝鲜半岛的受降区域的分界线。16日，斯大林复信表示"基本上不反对命令的内容"，对于有关朝鲜分界线的问题也没有提出异议。
9月2日，麦克阿瑟在日本东京湾密苏里战舰上举行的日本投降签字仪式后，发布了"总命令第一号"，其内容根据斯大林的提议略有修改。命令提到："驻北纬三十八度线以北的韩国、满洲、库页岛、千岛列岛等地的日本高级指挥官以及陆海空和辅助部队，应向苏联远东军最高司令官投降；日本帝国主义政府大本营和驻日本本土及其周围诸岛以及驻北纬三十八度线以南的韩国、琉球列岛等地的日本高级指挥官以及陆海空和辅助部队，应向美国太平洋地区陆军最高司令官投降。"
就这样，"三八线"作为美苏两国在朝鲜受降和实行军事占领的分界线便被明确地规定下来。受降命令传到战地时，分兵进击的苏联军队已经越过"三八线"，正沿着公路向汉城推进。接到关于分界线的命令后，苏军迅速撤回"三八线"以北。9月8日，首批抵达朝鲜的美国军队第7步兵师在仁川登陆，对朝鲜"三八线"以南实施军事占领。
"三八线"斜穿朝鲜半岛，长约300公里，它截断了75条小溪和12条河流，以不同的角度越过崇山峻岭，穿过18条小路、104条乡村土路、15条道际公路和8条高级公路，以及6条南北铁路线。"三八线"以南农业人口占三分之一，基本上是农业区，历来向全国提供粮食；"三八线"以北由于拥有发达的水电资源，全国大部分工厂设在北方，包括化工、钢铁、水泥和化肥工厂等，其产品支援南部的农业经济。南北双方在经济上都无法做到自给自足。因此，对于行政管理和经济发展来说，"三八线"都是一条极不合理的分界线。
"三八线"对于所谓的受降的军事意义只是表面的和暂时的，苏美两国对"三八线"的确认包含着深远的政治意义和战略考虑。"三八线"对美国来说，其真实含义就是要阻止苏联利用参加对日作战的机会，控制整个朝鲜。早在1944年5月的一份美国国务院的文件中就警告说，如果苏联独占朝鲜，美国认为这将会危及未来太平洋地区的安全。因此"三八线"就被美国赋予了遏制苏联的政治意义。同样，苏联接受"三八线"为界的方案，也有其政治目的。按照当时的军事态势，苏联完全可以拒绝"三八线"，提出以"三七线"甚至更南的一条线为军事分界线，而美国从实际出发也不得不接受这种修正方案。但斯大林却毫不犹豫地同意了"三八线"为分界线的提议。
第二次世界大战后期，美苏两国之间已出现分庭抗礼的趋势，"三八线"的划定为美苏两国在远东和朝鲜半岛的冷战格局奠定了基础。"三八线"成为美苏两国以及后来形成的以美苏为核心的世界两大敌对阵营在朝鲜半岛对垒的楚河汉界，双方各占一个势力范围，用除战争以外的一切手段进行相互遏制和竞争，但军事力量不得过河犯界，否则便是犯规。一旦朝鲜打起内战，必然会越过"三八线"，这就意味着打乱了半岛上的大国均势，两大阵营的力量便会不可避免地、不同程度地卷入战争。因此，"三八线"作为军事分界线的划定为朝鲜内战及其所引发的多国战争种下了祸根。